Q & A

A1：Coliscan Easygel含有2種酶是特殊的化學製品（X-gluc和Red Gal）稱為chromogens。全部的大腸桿菌（包括E. coli）產生的酶會對Red Gal發生反應並產生粉紅\紅色，因此當它們長在Coliscan Easygel裡面或上面時，大腸桿菌落就染成粉紅\紅色。與其它的大腸桿菌相較下，大腸桿菌群E. coli就很特別，除了產生對Red Gal發生反應的酶外，還會產生對X-gluc發生反應的酶，於此產生的顏色作用在基質上為藍綠色。總之，E. coli會同時產生兩種反應酶，這兩種顏色粉紅\紅色加上藍綠色就變成深藍\紫色。記住對大部分的E. coli是如此，但還是有極少的例外會突如其來的出現在樣品上。例如：E. coli 0157：H7（”Jack in the Box”）就不產生glucuronidase，因此在Coliscan 上呈現的就是粉紅色。另外也有極少數的E. coli產生glucuronidase，但不產生galactosidase，因此在Coliscan 上呈現的就是藍綠色。絕大多數（估計範圍佔93-97％）的E. coli 菌種符合此典型的模式，所以Coliscan 成為非常可靠的方法。

Q2：為什麼有些E coli. 菌落呈現較紫色而有些則呈現較深藍色？

A2：因為在環境裡有數以千計的E coli. 菌種，每一菌種所產生的酶不同、多寡亦不同所致。所以如果有一菌種產生很多的Red Gal酶而X-gluc酶只有一點點，顏色就會比較偏紫色（通常會有粉紅色的暈圍繞著它）。反觀，如果有一菌種產生的Red Gal酶很少而有較多X-gluc酶，顏色就會比較深藍色（通常不會有顯而易見的粉紅色暈）。因此，任何菌落看起來是藍色或紫色的就是E. coli，因為這顯示兩種不同的酶都產生了。藍綠色菌落嚴格來說不是大腸桿菌，比較接近的有機體是變形桿菌屬（Proteus）或沙門氏菌（Salmonella）或異常的E. coli。唯一能確認特性的方法是在合格的實驗室做進一步的生物化學試驗。

A3：首先，你必須知道一件事，E. coli菌落是最先呈現在培養皿上的。因為它會產生兩種酶因此有加倍的染料，所以反應速度較快、色澤亦較深。其他的大腸桿菌只有一種酶，會產生較淡的粉紅色而且產生的速度視其活動力而定。故E. coli是最先看到的並且是很清楚的藍色，其他的大腸桿菌出現得較慢些而且一開始呈現很淡的粉紅色（藍綠色出現的也較慢、顏色最初也是很淺的綠色）。

再則，真正藍綠色菌落不會產生粉紅色的暈，只會有淺綠色的暈。判定真正的E. coli菌落的方法有兩種（1）沒有顯而易見的暈，或者（2）有顏色明確清楚的粉紅色暈。如果你是用Coliscan Membrane Filter培養基，確認E. coli非常簡單只要放置一小滴的Kovacs Reagent試劑在要試驗的菌落上。這個，試驗indol的存在與否，E. coli會有indol產生但其他的大腸桿菌一般都不會有，因此10秒鐘內E. coli菌落會有一櫻桃紅點環繞它。

Q4：當我在計算菌落數時菌落的大小是不是很重要？

A4：是的，菌落的大小與幾個因素有關。首先，你要知道與大部分的細菌相比較下，E. coli和其他的大腸桿菌長得相當快速，它們通常最先出現在培養皿， 48小時後才出現的任何菌落不必理會它。其次，如果你在低溫（室溫）培養，菌落不會很快出現，此時，你必須在最早的有顏色的菌落出現後，至少還要再等18-20小時讓它繼續的生長和發展，才可開始計算結果。在35℃ 48小時內菌落長成的大小不超過大頭針（＜0.25㎜）也不用理會，尤其是後來才出現的。這個規則有個例外，如果培養皿裡有許多菌落而且它們很緊密的覆蓋在一起，整個培養皿看起來好像一點菌落也沒有，倒是像有粉紅色或帶藍色的敷藥遍及整個培養皿。菌落長在實心的培養基裡會比長在表面上的小，同樣的，長在裡面和表面的菌落如果太擁擠太靠近，它們也不會長的很大，很少會有大而且有顏色的點長在培養皿中培養基的表面上或裡面。常出現的結果是菌落長在培養皿的邊緣並且在培養基底部，這裡有極度的水分可以讓它延展開來，它應該以一個CFU（colony forming unit）來計算。

Q5：一個培養皿上能精準的算出的最大數量的菌落是多少？

A5：標準的規則（Standard protocol）中對大部分的樣品而言，培養皿中含有300菌落以上的應該視為TNTC（too numerous to count），不過，如果你很小心的話，還是有可能達到相當準確的結果或估算到1000菌落/培養皿的程度。最好的方式是計算菌落時，在培養皿下放置一光源，這樣可以很容易的看到菌落，並且用細筆尖的筆一面算一面做記號，這樣可避免重複算。

Q6：我如何知道樣品的量需要多少？

A6：你必須進行實驗或根據以往的經驗來判斷。地表上的水如湖水和河流，開始時我們建議從1mL/培養皿來做，如果你已經知道只有少量細菌在水中，那可以加至5mL/培養皿來做。倘若水樣品中有大量的標的有機體（E. coli），欲加入培養基時須要先稀釋。例如：要檢驗的水中含有500 E. coli/ mL，此時採用1 mL樣品將使得一個培養皿就有500 E. coli CFU這樣的數值太高了。因此10倍的稀釋是需要的而且1mL的10倍稀釋水將只有50 E. coli CFU/培養皿，這樣比較好算且結果也比較準確，稀釋也會減少幕後的有機體這是好的。

Q7：如何來稀釋樣品？

A7：你需要一個消毒過量過的稀釋液，最簡單的方式（如果你希望符合正式的標準規則這不是最好的方法）煮沸一些蒸餾水或除去離子的水來消毒它，這將殺死任何可能存在的大腸菌。用消毒過的容器量出90mL並等它冷卻，冷卻後加入10mL的樣品水到這個90mL的稀釋液，蓋上蓋子搖動至少25次。打開並取出1mL的稀釋樣品水混合入培養基裡，當你在計算標的有機體時，你必須把所算得的菌落數 ×10以得到原始未經稀釋水樣1mL中真正的菌落數。（如果培養皿中有50 E.coli菌落，那就有500E.coli/mL在原始未經稀釋水樣）

Q8：為什麼要有兩種不同的方法Coliscan Easygel和Coliscan MF，來測定E.coli和其他的大腸桿菌？我應該如何選擇較合適的方法？

A8：在正確使用時兩種方法Coliscan Easygel和Coliscan MF都可以達到不錯的成果。Easygel是設計給：樣品裡標的有機體/mL 的數值已經相當的高，所以當一次1-5mL樣品直接加入培養基時，培養皿中CFUs的值剛好可以準確地被數清楚。也就是說，當純粹的水樣品直接被使用加入培養基時，培養基對一個CFU/mL或一個CFU/5mL會有高的靈敏度。換句話說，就一個5mL的樣品而言，一個肉眼可見的標的有機體/20mL可被探測到，這是相當靈敏，但是它沒有辦法達到聯邦政府對飲用水0E.coli/100mL的要求。因此，要符合上述的要求，MF方法是最好的了。不管如何，大部分環境的地表水有一個有意義的數目E.coli/100mL，雖然樣品的量很少，但對於＃/所給的量也會產生很準確的反應（許多義工把他們的資料轉換成＃/100mL）。對5mL水樣品固守著沒有E.coli菌落存在而你必須知道是否實際上有一些/100mL存在，你必須用5mL的量，使用Easygel的方法至少做5個培養皿以上，或者你可以用MF的方法，取任何量的樣品/培養皿。因此，測試樣品的標的有機體很低而且需要確認到底有沒有或有很少的標的有機體存在，MF方法就是專門為這種情況設計的。Easygel的方法是很傑出適合用在試驗品中的標的有機體的族群總數是相當大的數目的情況，MF的方法在標的有機體很多時要稀釋原試驗液才不致於有過多的CFUs/培養皿產生。

Q9：我需要細菌培養器和多久的時間來培養這些培養皿？

A9：不，並不需要用價格昂貴的細菌培養器才能得到好結果。溫度只要在把樣品加入培養皿後，細菌能灌入培養基中成長且膠化即可。所以，培養皿必須放在溫暖的區域讓它成長，可以放在一個盒子裡置於暖氣通風設備上，更進一步是放在泡沫塑料盒裡，裡面放置一瓶非常熱的水（當蓋子蓋得很緊時，水會擴散出來盒子裡會溫暖的如同一個好的細菌培養器一樣維持8-10小時，水涼了可重覆換用熱水直到不需要為止）。有些人用熱帶子自己製作細菌培養器，有些則在泡沫塑料盒或硬紙板盒裡放置一個燈泡，這樣可保持溫度穩定。如果用燈泡需要用檔板遮著培養皿不要光線直接照射到，也要確定燈泡並不接觸到任何可能使其燃燒的東西，你要能達到穩定則溫度要能控制在85-95F，大部分的目的是用來誘發快速的成長。如果你不是用自動調溫控制的細菌培養器，從24小時起，就必須每隔一段時間檢查培養皿，直到你能看見藍或粉紅色的點發展中。然後繼續讓它在培養24小時才計算數目。我們高度建議買一個小、不是很貴的孵蛋器這就能操作的非常好。這些在賣農場東西的店舖就可找到價錢不超過＄40，我們最喜歡的是G.Q.F.製造Savannah,Georgia.（電話912-236-0651，型號＃1602N Hovabator Incubator）這些附有可調節的自動調溫器和溫度計，我們的實驗室裡有一部這樣操作的器具10多年來不曾有過問題。如果你正在做不間斷的試驗，這價錢相當合適，而且有一部這種器具減少了在培養期間大的溫度變動所產生的差異。如果設定培養器的溫度為35℃，你就可以在把培養皿放入培養器中24小時後計算結果了。任何菌落發展在48小時後的不要計算了，你在監測的E.coli和 coliforms長得很快而且在這段時間內也一定可以很清楚的看見了。

Q10：我可以用Coliscan來做 ”Fecal Coliforms”（糞生大腸桿菌群）？

A10：可以的。”Fecal Coliforms” （糞生大腸桿菌群）就是指大腸桿菌群會在44.5℃時成長的，大部分的E.coli菌種會在這個溫度成長而且有些其他的大腸桿菌群也可能是排泄物來源的。因此，如果你有一部培養器溫度設定在44.5℃，你就可以做糞生的。這時所必須遵守的協定是前2小時先設培養溫度為35℃，如果培養器是烤箱你應該用塑膠袋封好以免在培養時乾掉了，適當的規則要求水浴的培養器。應該指出Coliscan培養基比其他推薦測驗糞生大腸桿菌群的方法好，因為Coliscan培養基不僅能確定糞生大腸桿菌群的存在能知道它的量，而且能區別E.coli和其他菌種的糞生大腸桿菌群。這就是，E.coli總會存在排泄物中且呈現紫/深藍色的菌落，其他的糞生大腸桿菌群則呈現粉紅色的菌落，而其他非糞生有機體是對溫度有耐性的在培養基中為白色或無色的。”total fecal coliform”在Coliscan培養基中就是藍色和粉紅色的總和。區別藍色的E.coli和粉紅色的糞生大腸桿菌群是很重要的，因為有許多其他菌種的大腸桿菌群它們不是糞生來源卻對溫度有耐性，所以，如果沒有對溫度有耐性的E.coli顯現在培養皿中，而是粉紅色的對溫度有耐性的菌落存在，糞生來源就是疑問了。

Q11：我如何知道報告中指出的比較不同的方法的研究是有根據的？那些研究結果的結論是正確和有效的？

A11：我們從許多來源收到也看到一些數據和評論，他們表示有對（1）準確度的評價（2）使用的方便性（3）我們的Coliscan培養基的解釋的評鑑。我們承認有些方向和經驗對菌落的顏色的解釋是沒有價值的，我們相信Coliscan的方法在它們的可用性和準確上是數一數二的。事實上設計完善的研究支持這個理論，不幸的是許多人試著從設計不良或已經執行的研究裡不正確的數據來做結論，些許一般易犯的錯誤如下。

1.第一個因素我將提及的是缺少replications，任何做比較的研究都應該依據最少3個以上的replications。也就是說從相同試驗品來的，至少3個以上的相同樣品，它們應該在Coliscan培養基和其他的培養基裡一起進行來比較。Replications需要確定遵守正確的和規定的協定就沒有操作者的錯誤存在，例如：如果要比較是有效的就應該要有一個大的試驗品，讓所有培養基的replications都一樣，而且要能在短時間內讓同一個操作者在相同的情況下做完。這個樣品不可被切割開來而且有一部分要寄給外面的實驗室同時剩下的留下來使用。（這結果標的有機體會有完全不同發育的族群，就像因為不同的操作員會有重大的差異一樣）

2.一個常常會犯的錯誤是試著用不正確的數據來證實方法。例如：存在很小數目的實際的菌落在標的有機體/培養皿會逐漸的產生大量顯著的變動。當有少於10菌落出現時，1或2 個菌落的差別可能會有重大的差異。像是，樣品大小為1mL，有一個培養皿有6菌落而另一個培養皿有8菌落，如此一來＃/100 mL就依序有600和800。這似乎是大的量，但對小數目的菌落而言可能沒有重要的不同。再則，樣品大小為1mL，一個培養皿有1菌落而另一個培養皿有3菌落，就有了300％的變動如果呈現在表上或圖形上它們無法注意到原始呈現出的確實的菌落的數目，這就很糟了。這可能誤導並產生非常不正確的傾向。這就是為什麼大部分被設計用來改良使用方法的的研究中需要指出最小值和最大值的標的菌落/培養皿，此被視為一般的協定的一部分。例如：使用MF 方法時的數目一般規定為20-60菌落/培養皿。

3.另一個在研究時會牽扯進來的因素是有機體存在試驗樣品中的類型的變動。從自然環境中取得的樣品對某一有機體可能有很大量的族群而缺少其他的類型的族群，這樣的研究根據的樣品只從1、2個地點可能缺乏多樣性，無法滿足試驗方法的需求。相反的，研究時所根據的樣品如果斬釘截鐵的早就知道有哪些變種或有機體不包括一些類型，也將產生偽陽性或陰性反應的錯誤，所以，一個表面絕佳的方法（從研究上）可能不優於自然樣品中含有更多細菌類型的。這幾個因素是在評估一個方法時必須考慮的，很明顯的必須小心的儘可能去掉許多的變異數，這樣的結果才是真正有意義，並不是為了顯現重要意義，也不是因為用粗劣的設計才有效，這個研究的執行和解釋還在討論中。統計分析是非常有用的工具，但當數據是被操縱的或因為粗劣的原設計而提供不正確的數據時，這樣的結果很容易令人產生誤解，常常不被說出來的比被說出來的還更重要。例如：有一個很有名的方法打廣告說是”低偽陰性”卻忘記提及他們的其中一個研究出版報告說總大腸桿菌群超過50％偽陽性反應。

4.有些人試著拿Coliscan Easygel和Coliscan MF方式/方法和其他的方法比較，他們宣稱可以區辨E. coli和其他大腸桿菌群並知道它們的量，這兩個方法是Hach 的ColiBlue membrane filter 培養基和 3M 的Petrifilm EC培養基。他們的方法都有一些限制，例如樣品的大小和使用的容易和解釋。一個主要的因素你必須知道的是這些培養基跟Coliscan培養基類似，他們宣稱E. coli呈現藍色菌落而且其他大腸桿菌群是為紅色菌落。無論如何，他們的技術一定和Coliscan培養基不同，因為Micrology Labs擁有專用的權力，就是在一個培養基上同時使用2種chromogenic enzyme 特殊基質來分辨E. coli和其他大腸桿菌群的專利。代替X-gluc 和Red Gal（Coliscan的專利配方），他們用X-gluc和一種tetrazolium salt的組合在他們的培養基，也就是說因為X-gluc的原因他們算出的E. coli可能正確但是tetrazolium salt把全部其他的細菌菌落都染成紅色，無法判別是真的大腸桿菌群或一些相關的細菌。這就是為什麼他們沒有不同色度的藍/紫色在E. coli和為什麼他們的大腸桿菌群全是整齊劃一的暗紅色在培養皿中看起來很細緻。他們宣布包含抑制劑可避免非大腸桿菌群生長，這並不全然可能，有非常多的細菌類型是非大腸桿菌群但事實上可以在適合大腸桿菌群生長的環境生長。結果是這些抄襲者的培養基在確認total coliform counts 和一般的大腸桿菌群時會導致高偽陽性反應的錯誤。（1997年Hach 公司Grant發表，他承認有52％偽陽性反應的錯誤因為用m-ColiBlue 24 培養基來檢驗total coliforms）。研究必須小心的檢視來決定他們所缺少的設計和數據有缺點，而且一個方法被試驗時，技術人員應該確定他們了解技術和任何有可能產生負面的缺點，例如，在培養基裡的微生物可能被tetrazolium salt抑制。在Micrology Lab裡做了相同的培養基和情況的比較，但加了tetrazolium salt到其中一個培養基，結果發生了含有tetrazolium salt的培養基裡較少發現有機體。

Q12：在Coliscan的盒子上有一張貼示說它必需要冷凍儲藏，但當我打開盒子時，培養基是解凍成液體的，這樣有問題嗎？

A12：不會，這樣不會有任何問題。培養基在室溫時可以解凍幾個禮拜不會有不利的影響，只要把裝Coliscan液體的瓶子放在冷藏箱即可。相同的，如果你發現解凍太多時，只要把他們再冷凍即可不會有任何問題。我們把Coliscan放在室溫一個月沒有發現任何顯著的負面影響，但是長期儲藏的話最好冷凍，因為chromogenic基質在高溫超過時間會慢慢的失去它們的鮮明的顏色。

A13：這不是汙染。水滴不會影響膠化或實驗結果。（乾燥、有霜狀的培養皿也能執行的很好，不會對你的結果有不利的影響，它們會發生是因為是儲藏在很乾燥的狀態）

Coliscan 是 Micrology Laboratories的註冊商標。

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